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免疫组化抗原热修复技术要点

 
 


1,抗原热修复温度与时间的关系

我们日常工作中使用的组织固定剂福尔马林可导致组织蛋白质或蛋白质之间的亚甲基桥接。具体过程如下:

第一步是福尔马林和氢气形成新化合物的基本反应。

第二步是福尔马林和氢气形成新的亚甲基桥的基本反应。

作为上述反应的结果,许多抗原决定簇被阻断,并且加热可以水解桥以活化抗原。影响抗原热修复的两个最关键因素是温度和时间。有些人总结了这两个因素对抗原修复的影响,如下式所示:

抗原热修复的有效性=加热温度(T)×加热时间(t)

也就是说,修理时的温度越低,修理所需的时间越长;反过来,当修复温度升高时,可以适当地缩短修复时间,从而抗原决定簇完全暴露,并且反比关系与抗体有关。实验结果也可以在表1中清楚地看到。

2,组织固定时间与所需抗原热修复的关系

大量实验表明,固定时间试样越长,桥形成越紧,激活抗原越困难,所需的修复强度越强。有趣的是,随着固定时间的延长,组织中蛋白质对温度的耐受性也增加(如图1所示),这可能是在固定时间内增加样本修复强度的理论基础。

这提醒我们,我们必须注意进行回顾性研究时所使用的修复条件。它必须与新鲜标本的修复条件不同。在相同条件下,有必要延长修理时间或增加修理温度。可以获得满意的结果。

3,不同pH抗原修复液对染色结果的影响

用于抗原热修复的修复液的pH也对染色结果具有相当大的影响。 pH对染色结果的影响可大致分为以下四种情况。

A稳定型,PH值对染色效果影响不大,如PCNA,AE1,EMA,CD20等。

B-V型,高PH值和低PH值染色效果较好,但PH值4-5染色效果差,如ER,Ki-67。

C-rise型,随着PH值的增加,染色效果逐渐增强,如HMB45。D-衰减型,染色效果随着PH值的增加而逐渐降低。当然,这种类型的抗体只是个体现象,例如MOC31。一个有趣的现象值得注意,即在高pH值(图中所示的圆圈中约为8.0~9.0),A,B和C均具有更好的染色结果,因此目前强烈推荐的抗原修复溶液是高pH值值得修复液,如1mM EDTA,PH8.0或PH9.0。然而,由于传统做法,大多数医院和实验室使用PH6.0柠檬酸盐缓冲液。结合上述各种抗体的染色状态,考虑到临床工作的实际情况,许多国外免疫组化专家建议,在常规免疫组化工作中,使用所有高价值恢复修复液代替目前广泛使用的PH6。 0柠檬酸盐缓冲液。为此,该公司为PH8.0和PH9.0推出了一种新的抗原修复解决方案。

4,抗原热修复的手段

微波炉维修与压力锅维修的比较

温度压力v加热时间

微波炉100°C 1P 15~20分钟不均匀

压力锅120°C 1.2P喷射2分钟均匀

石蜡切片免疫组化染色步骤

三步法(以SP套件为例)

●石蜡切片脱蜡成水。

●用蒸馏水冲洗并在PBS中浸泡5分钟。如果使用抗原修复,可以在该步骤之后进行。

●在室温下孵育3%H2O2 5-10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性,用PBS冲洗2分钟×3次。

●封闭5~10%正常山羊血清,室温孵育10分钟。排出血清,不要洗涤,加入适当稀释的一抗或一抗工作溶液,在37°C下孵育1至2小时或4°C过夜。

●PBS冲洗,2分钟×3次。

●加入适当稀释的生物素标记的二抗(用1%BSA-PBS稀释),37°C孵育10到30分钟,或加入第二代生物素标记的二抗工作溶液,37°C孵育或室温10~20分钟。

●PBS冲洗,2分钟×3次。

●加入适当比例的辣根标记的链霉抗生物素蛋白(在PBS中稀释),在37°C下孵育10至30分钟;或第二代辣根标记的链霉抗生物素蛋白工作溶液,在37°C或室温下孵育10~20分钟。●PBS冲洗,2分钟×3次。

●开发人员颜色开发(DAB或AEC)。

●自来水经过全面冲洗,复染,脱水和透明,并密封。

?如有必要,avdin可用于阻断内源性生物素。

免疫组织化学染色步骤用于冷冻切片

●冷冻组织

●冷冻切片4~8μm,冷冻切片未染色后,必须干燥,保存在低温冰箱中,或暂时预先固定,-20℃保存在冰箱中。

●在室温下静置30分钟后,将其在4℃的丙酮中固定10分钟。您也可以根据需要选择其他固定方法。

●PBS冲洗,5分钟×3次。

?与3%过氧化氢孵育5至10分钟,以消除内源性过氧化物酶活性。

●PBS冲洗,5分钟×3次。

●石蜡切片的免疫组织化学染色的下一步(从添加一抗开始)。

摘自:中国分析测量网络

[关键词]抗原热,免疫组化,奥克官方网站

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